自噬的步骤可以大概总结为下面四步:步骤1:细胞接受自噬诱导信号后,在胞浆的某处形成一个小的类似脂质体样的膜结构,然后不断扩张,但它并不呈球形,而是扁平的,就像一个由2层脂双层组成的碗,可在电镜下观察到,被称为Phagophore,是自噬发生的铁证之一。步骤2:Phagophore不断延伸,将胞浆中的任何成分,包括细胞器,全部揽入碗中,然后收口,成为密闭的球状的autophagosome,即自噬体。电镜下观察到自噬体是自噬发生的铁证之二。有2个特征:一是双层膜,二是内含胞浆成分,如线粒体、内质网碎片等。步骤3:自噬体形成后,可与细胞内吞的吞噬泡、吞饮泡和内体融合(这种情况不是必然要发生的)。步骤4:自噬体与溶酶体融合形成autolysosome,期间自噬体的内膜被溶酶体酶降解,二者的内容物合为一体,自噬体中的货物也被降解,产物(氨基酸、脂肪酸等)被输送到胞浆中,供细胞重新利用,而残渣或被排出细胞外或滞留在胞浆中。由于自噬体属于亚细胞结构,普通光镜下看不到,因此,直接观察自噬体需在透射电镜下。大连双荧光自噬
自噬是一个吞噬自身细胞质蛋白或细胞器并使其包被进入囊泡,并与溶酶体融合形成自噬溶酶体,降解其所包裹的内容物的过程,借此实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。自噬在机体的生理和病理过程中都能见到,其所起的作用是正面还是负面的尚未完全阐明,对瘤子的研究尤其如此,值得关注。自噬是由Ashford和Porter在1962年发现细胞内有“自己吃自己”的现象后提出的,是指从粗面内质网的无核糖体附着区脱落的双层膜包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等成分形成自噬体,并与溶酶体融合形成自噬溶酶体,降解其所包裹的内容物,以实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。大连双荧光自噬正常细胞自噬增强,可表现出阻止**发生的功能。
目前越来越多的研究结果揭示了细胞自噬在天然免疫反应中的重要调控作用,崔隽教授课题组先后发现选择性自噬能够通过调控天然免疫受体和适配体分子AIM21、cGAS2、RIG-I3、MAVS4以及经典NF-kB信号通路中IKKb激酶5的蛋白稳定性,负向调控炎症反应和I型干扰素反应的新通路。本项工作进一步揭示了选择性自噬对非经典NF-kB通路中转录因子的动态调控,加深了我们对于选择性自噬和天然免疫信号通路之间密切联系的认识。许多研究已将自噬缺陷作为神经退行性疾病的病理原因之一,包括阿尔茨海默病,帕金森氏病和亨廷顿氏病等等。
由于分子生物学的发展,已经诞生了mRFP-GFP-LC3双荧光自噬指示体系,用于标记及追踪LC3以及自噬流的变化。其中GFP是酸敏感型GFP蛋白,而mRFP是稳定的荧光表达基团,不受外界影响。由于自噬小体进入第二阶段后,与溶酶体进行融合,形成自噬溶酶体。自噬溶酶体由于溶酶体内部的酸性环境,可以导致PH下降,GFP淬灭,因此,GFP的减弱可指示自噬溶酶体形成的顺利程度,GFP越少,则从自噬小体到自噬溶酶体阶段流通得越顺畅。反之,自噬小体和溶酶体融合被阻止,透射电镜下观察自噬体的形成:自噬经历了:吞噬泡--自噬小体--自噬溶酶体透射电镜下吞噬泡的特征为:新月状或杯状,双层或多层膜,有包绕胞浆成分的趋势。自噬小体的特征为:双层或多层膜的液泡状结构,内含胞浆成分,如线粒体、内质网、核糖体等。自噬溶酶体的特征为:单层膜,胞浆成分已降解。自噬溶酶体进程受阻。mRFP是一直稳定表达的,因而可以通过GFP与mRFP的亮点比例来评价自噬流进程。自噬作用是一个高度保守的细胞机制。
选择性自噬是真核生物体内清理蛋白、受损细胞器和外源微生物的基础生理过程。而蛋白的翻译后修饰,特别是泛素化修饰能够作为选择性自噬中的底物识别的重要信号。崔隽教授课题组发现选择性自噬参与调控非经典NF-kB信号通路的重要过程。选择性自噬中的货物受体p62通过识别p52/p100的N端上的K63泛素化链进而促使p52/p100发生自噬降解,阻止非经典NF-kB信号通路。有趣的是,已有报道认为p100C端的K48泛素化链是蛋白酶体降解信号。而崔隽教授课题组发现的K63泛素化链修饰并非大家所熟知的蛋白降解信号,但却能被自噬货物受体p62识别并介导蛋白降解,进而调控底物功能,影响生理与疾病进程。当自噬体与溶酶体融合后,形成自噬溶酶体。大连双荧光自噬
分子伴侣介导的自噬(CMA):胞质内蛋白结合到分子伴侣后被转运到溶酶体腔中,然后被溶酶体酶消化。大连双荧光自噬
自噬是细胞消化掉自身的一部分,即self-eating,初一看似乎对细胞不利。事实上,细胞正常情况下比较少发生自噬,除非有诱发因素的存在。这些诱发因素比较多,也是研究的热门。既有来自于细胞外的(如外界中的营养成分、缺血缺氧、生长因子的浓度等),也有细胞内的(代谢压力、衰老或破损的细胞器、折叠错误或聚集的蛋白质等)。由于这些因素的经常性存在,因此,细胞保持了一种比较低的、基础的自噬活性以维持自稳。自噬过程比较快,被诱导后8min即可观察到自噬体形成,2h后自噬溶酶体基本降解消失。这有利于细胞快速适应恶劣环境。大连双荧光自噬
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